Auch der Seminarbetrieb blieb durch das NS-Regime nicht verschont. Katholische Jugendverbände und kirchliche Gruppen gerieten in Bedrängnis, Priester verhaftet. Als der damalige Papst Pius XI. 1937 mit einer Enzyklika (päpstliches Rundschreiben über Glaubensthemen) gegen den Nationalsozialismus Stellung bezog, wurde in ganz Deutschland eine Kampagne gegen Geistliche und Ordensleute gestartet. Priester wurden verhaftet; man warf ihnen „Sittlichkeitsverbrechen“ vor und stellte sie vor Gericht. Die Anschuldigungen waren in den meisten Fällen haltlos.
1939 umfasste das Alumnat 106 Kandidaten. Mit Kriegsbeginn wurden viele in die Wehrmacht eingezogen. Der erste von ihnen fiel bereits in der zweiten Kriegswoche – ihm sollten bis zu Kriegsende fünfundzwanzig seiner Mitbrüder folgen. Die Bamberger Hochschule musste noch im ersten Kriegsmonat ihren Betrieb einstellen, die verbliebenen Studenten wurden zum Unterricht nach Eichstätt geschickt. Mit der Diakonenweihe verließen 1942 die letzten Alumnen das Bamberger Seminar; im Gebäude richtete ein Reservelazarett ein.